Murat Türkoğlu, Cihat Dündar, Hakan Sevinç, Songül Kılıç. Biota Laboratories R&D Center, Sancaktepe, Istanbul, Turkey
Аннотация
Исследования показали, что местное применение 5%-ного раствора миноксидила дважды в день эффективен при многих видах выпадения волос. Однако некоторые растительные экстракты во время клинических исследований дали аналогичный эффект пролонгации фазы анагена. В этом исследовании препарат миноксидил, который применяется против выпадения волос, сравнивали с растительным экстрактом с использованием клеток эпителиальных иммортализованных кератиноцитов линии HaCaT для исследования клеточной реакции на оба способа обработки. Клетки HaCaT инкубировали при 1%-ной концентрации раствора миноксидила и при такой же концентрации растительного экстракта.
Было осуществлено выделение общей РНК, синтез к-ДНК и анализ экспрессии генов (количественная полимеразная цепная реакция в режиме реального времени RT-qPCR). Комбинация составляющих растительного экстракта была следующей: ромашка аптечная (Chamomilla recutita), крапива жгучая (Urtica urens), крапива двудомная (Urtica dioica), хвощ полевой (Equisetum arvense), тысячелистник обыкновенный (Achillea millefolium) и рожкового дерева (Ceratonia siliqua).
Результаты анализа экспрессии генов показали, что растительный экстракт и раствор миноксидила вызвали значительное снижение экспрессии генов интерлейкина 1-альфа (IL-1α). Применение растительного экстракта привело к пятикратному уменьшение экспрессии гена IL-1α, а обработка миноксидилом привела к ее снижению в три раза. На экспрессию генов стереоид-5α-редуктазы 2 типа (SRD5α2) растительный экстракт существенно не повлиял, однако она снизилась после обработки миноксидилом. Была выдвинута гипотеза, что влияние миноксидила на прекращение выпадения волос может быть обусловлено супрессией IL-1α и гена SRD5α.
1. Вступление
Исследования показали, что интерлейкин (IL-1) является мощным ингибитором роста волос. Кроме того, сообщалось, что он является важным фактором при гнездовой алопеции (гa), которая является болезнью волосяных фолликулов анагеновои стадии, и, как считается, имеет аутоиммунное происхождение [1, 2]. В изолированных волосяных фолликулах IL-1β снижал рост волос примерно на 60-80%. Это ингибирования роста волос опосредованно c AMP2. IL-1α и IL-1β разделяют общие рецепторы. Рюкерт (Rückert) и соавт. [3] показали, что высокие дозы противовоспалительных цитокинов, таких как IL-1β, индуцировали апоптоз кератиноцитов волосяной луковицы в условиях in vivo. В трансгенных мышей, в которых была гиперэкспрессия IL-1α в эпидермисе и внешний эпителиальной влагалище волосяных корней, наблюдалось выпадение волос. Согласно этому воспалительные цитокины могут индуцировать апоптоз внутри эпителия волосяного фолликула [4]. У пациентов с ГА, в которых обнаружены полиморфизм гена и наличие недостаточного количества антагонистов рецептора IL-1 было обнаружено более серьезное заболевание [2].
Было обнародовано много публикаций о механизме действия миноксидила. При ГА наружное применение 5% -ного раствора миноксидила 47 пациентами два раза в день оказалось эффективным [5]. Влияние миноксидила на стимулирование роста волос не зависит от гормонального или ингибиторного влияния на 5α-редуктазы.
Также сообщалось, что миноксидил повышает экспрессию мРНК для ФРЭС на уровне кожного сосочка [6].
При применении на клеточных культурах, миноксидил продолжил выживания и вызывал замедление старения кератиноцитов человека и влиял на клетки матрикса фолликулов, которые удлиняют фазу анагена [7, 8].
При рассмотрении научно доказанных воздействий миноксидила на рост волос, логичным представляется его использование в качестве эталона с целью сравнения любого другого препарата для содействия росту волос. Мы разработали растительный экстракт и провели клиническое исследование, чтобы показать его действие, заключалась в стимулировании роста волос [9]. Как сообщалось, ромашка лекарственная (Chamomilla recutita) в качестве активного ингредиента содержит апигенин [10], тогда как крапива жгучая (Urtica urens) и крапива двудомная (Urtica dioica) является источником кемпферол, мирицетин, линолевой кислоты [11], олеиновой кислоты [12 ], железа [13] и бета-ситостерол [14]. Хвощ полевой (Equisetum arvense) содержит апигенин, кемпферол и бета-ситостерол [15]. Вместе с апигенин и бета-ситостерол тысячелистник обыкновенный (Achillea millefolium) включает в качестве активных ингредиентов фолиевую кислоту и несколько минералов [16]. В свою очередь, рожкового дерева (Ceratonia siliqua) содержит токоферол, тиамин, рибофлавин, пантотеновую кислоту, фолиевую кислоту, цинк, медь и железо [17].
Сообщалось, что среди этих активных ингредиентов именно апигенин, кемпферол, мирицетин, линолевая кислота, олеиновая кислота, железо и цинк стимулируют рост волос [18]. В данном исследовании мы сравнивали влияние миноксидила и экспериментального экстракта на клеточную линию эпителиальных иммортализованих кератиноцитов человека (HaCaT).
2. Материалы и методы
2.1. клеточная культура
Клеточную линию кератиноцитов человека (HaCaT) культивировали в среде Игла в модификации Дульбекко (Dulbecco’s Modified Eagle’s medium, DMEM) с высоким содержанием глюкозы, дополненной 10% инактивированной теплом фетальной бычьей сывороткой (ФБС), 2 мМ L-глутамина и 100 ед. / Мл гентамицин. Клетки выдерживали в инкубаторе Нью Брунсвика (Newbrunswick) при 37 ° С и в увлажненной газовой среде при 5% содержания СО2. Все комплектующие и среды были приобретены в компании Сигма Алдрич (Sigma Aldrich).
2.2. Приготовление раствора миноксидила
522,5 мг миноксидила растворяли в 25 мл дистиллированной воды: нужно взять 25 мл смеси этанола для получения 5 мМ раствора миноксидила. Этот раствор использовали в качестве 100% образца; другие концентрации (10%, 5%, 3%, 1% и 0,2%) раствора готовили путем разведения дистиллированной водой.
2.3. Приготовление растительного экстракта
Растения были приобретены у поставщика растительного сырья, Мартин Бауэр Групп (Martin Bauer Group), Германия. В качестве растительных компонентов для экстракта использовались цветы ромашки (Chamomilla recutita), листья крапивы жгучей (Urtica urens), листья крапивы двудомной (Urtica dioica), листья хвоща полевого (Equisetum arvense), цветы тысячелистника обыкновенного (Achillea millefolium), плоды рожкового дерева (Ceratonia siliqua). Высушенные растения измельчали. Сорок граммов растительной смеси экстрагировали 500 мл дистиллированной воды в течение 3:00 при 100 ° C с использованием экстрактора Сокслета. Экстракт процеживали через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм.
2.4. Пролиферация клеток XTT, проба на цитотоксичность
Для анализа цитотоксичности использовали Набор для тестирования пролиферации клеток II (Roche XTT). Этот анализ основан на расщеплении XTT метаболически активными клетками, в результате чего образуется оранжевый формазановий краситель.
Количество оранжевого формазанового красителя определяют с помощью количественного анализа с использованием считывателя микропланшетов. Если коротко, клетки HaCaT засевали в 96-луночные планшеты (1х104 клеток / лунка) и подвергали различным концентрациям (100%, 10%, 5%, 3%, 1% и 0,2%) раствора миноксидила и экстракта растительного происхождения. После 72-часового периода инкубации 50 μl XTT и активаторного реагенты добавляли к каждому планшету в соответствии с инструкциями производителя. Затем клетки инкубировали при 37 ° С в течение 4:00 для того, чтобы реагент XTT был восстановлен в составляющей формазана.
Уровень поглощения измерялся в считыватели микропланшетов BIO-RAD (Япония) за вычетом 450 нм, фоновое измерения составляло 620 нм.
2.5. выделение РНК
Клетки HaCaT инкубировали при 1% -ной концентрации раствора миноксидила и растительного экстракта к тотальному выделения РНК. Тотальную РНК экстрагировали с использованием TRI-реагента в соответствии с инструкциями производителя Сигма Альдрич (Sigma Aldrich). Концентрацию и чистоту выделенных проб РНК определяли, измеряя оптическую плотность при 260 нм и 280 нм, используя устройство БиоСпек-нано (BioSpec-nano), Япония.
2.6. обратная транскрипция
Для получения обратной транскрипции был использован набор для синтеза первой нити кДНК Роше (Roche Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit). Синтез кДНК проводили с 500 нг суммарной РНК, конечной концентрацией 2 μM ген-специфических праймеров VEGF, KGF, IL-1α, SRD5α типа 2 и GAPDH (интегрированные ДНК-технологии), 10 ед. транскриптора обратной транскриптазы (Transcriptor Reverse Transcriptase), 20 ед. защитного ингибитора РНК-азы (Protector RNase Inhibitor), 1 мМ каждого компонента смеси дНТФ и транскриптор буферной обратной транскрипции 5X (Transcriptor Reverse Transcriptase Reaction Buffer 5Х) в соответствии с инструкциями производителя Роше (Roche).
2.7. Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени
Реакция ПЦР в реальном времени (RT-qPCR) проводилась в устройстве Light Cycler 96, Roche и использовался набор Fast Start DNA Green Master Kit (Roche). Если коротко, общий объем реакционной смеси составлял 20 μl, содержащий 10 м μl SYBR Green Master Mix (2X), 0,5 μl обратного и переднего праймеров (Таблица 1), 2,5 нг кДНК и соответствующее количество свободной от нуклеазы воды. Все образцы выполняли в трех экземплярах в каждом мероприятии, включая контролем без добавления матрицы и четырьмя стандартами (1:10, 1: 100 и 1: 1000). Параметры ПЦР определяли отдельно для каждой цели в соответствии с температур плавления и отжига праймеров. Каждый параметр включает стадию предварительной инкубации в течение 10 мин при 95 ° С и следующие 45 циклов 3-ступенчатой амплификации и стадии плавления. Анализ кривой плавления проводили для проверки клинической специфичности теста. Были выполнены три повтора анализа экспрессии генов (n = 3). Для количественного определения результатов RT-qPCR использовали метод ΔΔCt (2-ΔΔCt).
Таблица 1. Последовательность праймеров для выбранных генов (от 5' до 3')
2.8. Статистический анализ
Все данные являются репрезентативными для трех экспериментов и выражены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего значения (SEM).
Статистическую оценку проводили с помощью непарного t-теста с использованием программы Graph Pad Prism 5 Software (США), и результаты со значением г. меньше 0.05 были учтены как значимые.
3. Обсуждение
3.1. Анализ цитотоксичности
Раствор миноксидила и растительный экстракт в высоких концентрациях показали цитотоксический эффект на клетки HaCaT. Для дальнейшего анализа определена возможная высокая концентрация 1% (рис. 1).
Рис. 1 Результаты анализа цитотоксичности раствора миноксидила и растительного экстракта (штрихованных кубики отражают концентрации, выбранные для инкубации.)
3.2. Анализ экспрессии генов (qPCR в реальном времени)
Результаты анализа экспрессии генов с помощью RT-qPCR показали, что как и растительный экстракт, так и миноксидил вызвали статистически значимое снижение экспрессии гена IL-1α по сравнению с необработанными контрольными клетками. Растительный экстракт привел к 0,19-кратной изменения уровня экспрессии гена IL-1α, тогда как обработка миноксидилом привела к изменению в 0,34 раза (рис. 2).
Рис.2. Уровни экспрессии генов IL-1a, SRD5a2, VEGF и KGF после обработки растительным экстрактом или миноксидилом
Экспрессия гена SRD5α типа 2 не претерпела существенного влияния в связи с применением растительного экстракта. Однако она была снижена при использовании миноксидила (рис. 2). На экспрессию гена ФРЭС и ФРК значительно влияла обработка миноксидилом и растительным экстрактом – почти в равной степени. ФРЭС регулировался обоими способами: его экспрессия снижалась до одной седьмой количества необработанных контрольных клеток с помощью растительного экстракта, тогда как миноксидил уменьшал его до одной четверти контрольных клеток (рис. 2). И миноксидил, и растительный экстракт уменьшали экспрессию гена ФРК до одной шестой части контрольных клеток.
Недавнее исследование [19] показало, что использование Спрея с миноксидилом в составе дважды в день было эффективным для улучшения густоты волос на фронтотемпоральних и вертексных участках головы у мужчин. С другой стороны, наше клиническое исследование [9] показало, что одновременное применение сыворотки для волос и шампуня, в состав которого входят экстракты растений, уменьшило потерю волос у субъектов, страдающих от И и АГА.
Поэтому в этом исследовании миноксидил сравнивался с нашим растительным экстрактом на клеточном уровне. Согласно результатам наших исследований культуры клеток, миноксидил подавлял экспрессию SRD5α2, Фресом ФРК, а растительный экстракт подавлял ФРЭС и ФРК подобно миноксидилу (Таблица 2), однако он не показал значительного влияния на экспрессию SRD5α2.
Исходя из этих результатов, клинически одобрены эффекты миноксидила и нашего растительного экстракта на снижение выпадения волос не могут быть связаны с изменениями экспрессии гена ФРЭС и ФРК, поскольку уровни экспрессии обоих были неожиданно для исследования снижены как миноксидил, так и ботаническим экстрактом. Могут быть разные механизмы, с помощью которых миноксидил и наш растительный экстракт к уменьшению потери волос. Ингибирования 5α-редуктазы II типа может быть одним из таких механизмов действия миноксидила, но не нашего растительного экстракта (Рис.2). Среди факторов, которые мы тестировали, только на IL-1α одинаково повлияли и миноксидил, и растительный экстракт. Также, как и ожидалось, его экспрессию удалось снизить с помощью обоих средств. Растительный экстракт уменьшил экспрессию гена IL-1α до одной пятой количества эталона, подобной снижение до одной трети эталона при обработки миноксидил (рис. 2). Так как было показано, что IL-1α подавляет рост волосяного фолликула человека и стержня волоса в культивируемых клетках целостного органа, снижение содержания этого фактора может объяснять влияние нашего растительного экстракта и миноксидила на выпадение волос [20].
3.2. Анализ экспрессии генов (qPCR в реальном времени)
Результаты анализа экспрессии генов с помощью RT-qPCR показали, что как и растительный экстракт, так и миноксидил вызвали статистически значимое снижение экспрессии гена IL-1α по сравнению с необработанными контрольными клетками. Растительный экстракт привел к 0,19-кратной изменения уровня экспрессии гена IL-1α, тогда как обработка миноксидилом привела к изменению в 0,34 раза (рис. 2).
Экспрессия гена SRD5α типа 2 не претерпела существенного влияния в связи с применением растительного экстракта. Однако она была снижена при использовании миноксидила (рис. 2). На экспрессию гена ФРЭС и ФРК значительно влияла обработка миноксидилом и растительным экстрактом – почти в равной степени. ФРЭС регулировался обоими способами: его экспрессия снижалась до одной седьмой количества необработанных контрольных клеток с помощью растительного экстракта, тогда как миноксидил уменьшал его до одной четверти контрольных клеток (рис. 2). И миноксидил, и растительный экстракт уменьшали экспрессию гена ФРК до одной шестой части контрольных клеток.
Недавнее исследование [19] показало, что использование Спрея с миноксидилом в составе дважды в день было эффективным для улучшения густоты волос на фронтотемпоральних и вертексных участках головы у мужчин. С другой стороны, наше клиническое исследование [9] показало, что одновременное применение сыворотки для волос и шампуня, в состав которого входят экстракты растений, уменьшило потерю волос у субъектов, страдающих от И и АГА.
Поэтому в этом исследовании миноксидил сравнивался с нашим растительным экстрактом на клеточном уровне. Согласно результатам наших исследований культуры клеток, миноксидил подавлял экспрессию SRD5α2, Фресом ФРК, а растительный экстракт подавлял ФРЭС и ФРК подобно миноксидилу (Таблица 2), однако он не показал значительного влияния на экспрессию SRD5α2.
Таблица 2. Значение кратности изменения IL-1a / GAPDH, SRD5a / GAPDH, VEGF / GAPDH и KGF / GAPDH для клеток HaCaT, обработанных растительным экстрактом или миноксидилом
Исходя из этих результатов, клинически подтвержденные эффекты миноксидила и нашего растительного экстракта на снижение выпадения волос не могут быть связаны с изменениями экспрессии гена ФРЭС и ФРК, поскольку уровни экспрессии обоих были неожиданно для исследования снижены как миноксидил, так и ботаническим экстрактом. Могут быть разные механизмы, с помощью которых миноксидил и наш растительный экстракт приводят к уменьшению потери волос. Ингибирования 5α-редуктазы II типа может быть одним из таких механизмов действия миноксидила, но не нашего растительного экстракта (Рис.2). Среди факторов, которые мы тестировали, только на IL-1α одинаково повлияли и миноксидил, и растительный экстракт. Также, как и ожидалось, его экспрессию удалось снизить с помощью обоих средств. Растительный экстракт уменьшил экспрессию гена IL-1α до одной пятой количества эталона, подобной снижение до одной трети эталона при обработки миноксидил (рис. 2). Так как было показано, что IL-1α подавляет рост волосяного фолликула человека и стержня волоса в культивируемых клетках целостного органа, снижение содержания этого фактора может объяснять влияние нашего растительного экстракта и миноксидила на выпадение волос [20].
4. Выводы
Принимая во внимание все указанное выше, наша гипотеза состоит в том, что растительные экстракты, в состав которых входят различные растения, могут быть эффективными против выпадения волос. Однако их эффективность должна оцениваться плацебо-контролируемыми клиническими исследованиями, а также дальнейшими исследованиями клеточной, тканевой и органной культуры.
Список литературы
[1] Safavi KH, Muller SA, Suman VJ, Moshell AN, and Melton LJ. Incidence of alopecia areata in Olmsted county, Minnesota, 1975-1989. Mayo Clinic Proceedings, 70 (1995) 628–633.
[2] Hoffmann R, Eicheler W, Wenzel E, and Happle R. Interleukin-1beta-Induced Inhibition of Hair Growth In Vitro Is Mediated by Cyclic AMP. J Invest Dermatol., 10 (1997) 40–42.
[3] Rückert R, Lindner G, Bulfone-Paus S, and Paus R. High-dose proinflammatory cytokines induce apoptosis of hair bulb keratinocytes in vivo. British J. Dermatol., 143 (2000) 1036–1039.
[4] Groves RW, Mizutani H, Kieffer JD, and Kupper TS. Inflammatory skin disease in transgenic mice that express high levels of interleukin 1 alpha in basal epidermis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (1995) 11874–11878.
[5] Fiedler-Weiss C. Evaluation of oral minoxidil in the treatment of alopecia areata. Arch Dermatol., 123 (1987) 1488–1490.
[6] Lachgar S, Charveron M, Gall Y, and Bonafe JL. Minoxidil upregulates the expression of vascular endothelial growth factor in human hair dermal papilla cells. British J Dermatol., 138 (1998) 407–411.
[7] Cohen RL, Alves MEAF, Weiss VC, West DP, Chambers DA. Direct Effects of Minoxidil on Epidermal Cells in Culture. J Invest Dermatol., 82 (1984) 90–93.
[8] Baden HP, Kubilus J. Effect of Minoxidil on Cultured Keratinocytes. J Invest Dermatol. 81(1983) 558–560.
[9] Marzatico F, Nobile V, Oran S, and Turkoglu M. Clinical evaluation of an herbal extract against hair loss in telogen effluvium and androgenetic alopecia. Annals of Dermatol., 26 (2014) 31.
[10] Avallone R, Zanoli P, Puia G, Kleinschnitz M, Schreier P, and Baraldi M. Pharmacological profile of apigenin, a flavonoid isolated from Matricaria chamomilla. Biochem. Pharmacol., 59 (2000) 1387–1394.
[11] Otles S, and Yalcin B. Phenolic compounds analysis of root, stalk, and leaves of nettle. The Scientific World Journal 2012 (2012) 1–12.
[12] Guil-Guerrero J, Rebolloso-Fuentes M, and Isasa M. Fatty acids and carotenoids from stinging nettle (Urtica dioica L.). J. Food Composition and Analysis 16 (2003) 111–119.
[13] Turan M, Kordali S, Zengin H, Dursun A, and Sezen Y. Macro and micro mineral ontent of some wild edible leaves consumed in eastern Anatolia. Soil & Plant Science 53 (2003) 129–137.
[14] Yarnell E. Stinging Nettle: Alternative and Complementary Therapies 4(3) (2009) 180–186.
[15] Mimica-Dukic N, Simin N, Cvejic J, Jovin E, Orcic D, and Bozin B. Phenolic compounds in field horsetail (Equisetum arvense L.) as Natural Antioxidants. Molecules 13 (2008) 1455–1464.
[16] Chandler RF, Hooper SN, and Harvey MJ. ethnobotany and phytochemistry of yarrow, Achillea millefolium, Economic Botany 36 (1982) 203–223.
[17] Watson, R., Zibadi, S., and Preedy, V. Bioactive foods in promoting health fruits and vegetables. Academic Press, Amsterdam, 2010, pp. 245-247.
[18] Harrison, S., Bergfeld, W., and Andersen, F.A., Cosmeceuticals for Hair and Nail in Cosmeceutical Science in Clinical Practise, Ed. Sadick, N.S, CRC Press, USA, 2010 p. 63.
[19] Hillmann K, Bartels NG, Kottner J, Stroux A, Canfield D, and Blume-Peytavi U. A, Single-centre, randomized, double-blind, placebo-controlled clinical trial to investigate the efficacy and safety of minoxidil topical foam in frontotemporal and vertex androgenetic alopecia in men. Skin Pharmacol Physiol., 28 (2015) 236–244.
[20] Harmon CS and Nevins TD. IL-1 alpha inhibits human hair follicle growth and hair fiber production in whole-organ cultures. Lymphokine Cytokine Res., 12(1993) 197–203.
